Меню

Опыт использования метода ПЦР для выявления РНК ДНК возбудителей вирусных гепатитов В и С у серонегативных доноров

Опыт использования метода ПЦР для выявления РНК (ДНК) возбудителей вирусных гепатитов В и С у серонегативных доноров

О.А. Тарасенко, И.А. Гукасян, Л.В.Соболевская, Т.В. Черненко

Станция переливания крови Департамента Здравоохранения г. Москвы

В настоящее время исследование образцов донорской крови на маркеры вирусных гепатитов В (ВГВ) и С (ВГС) проводят серологическими методами: иммуноферментным (ИФА) или иммунохемилюминисцентным (ИХЛА) анализом, позволяющими определять наличие в них поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) и антител к белкам ВГС (анти HCV). Введение в лабораторную практику службы крови обязательного тестирования донорской крови на указанные серологические маркеры ВГВ и ВГС позволило значительно снизить риск посттрансфузионной передачи ВГС и ВГВ.

Известно, однако, что при ВГС специфические антитела появляются в среднем через 10-12 недель от момента заражения, а в некоторых случаях сроки их появления могут отодвигаться до 30-50 недель [2,6]. Поэтому при исследовании методами ИФА или ИХЛА образцов крови, взятой от донора с ранней стадией ВГС, когда антитела еще не выявляются (период, так называемого, серонегативного окна), получают, как правило, ложноотрицательный результат. В то же время именно в этот период ВГС наблюдается, выраженная виремия и связанная с ней высокая « инфекционная способность» инфицированной крови [3 ]. В связи с этим компоненты крови, заготовленные от донора, находящегося в периоде «серонегативного окна», являются основным источником заражения реципиента ВГС при гемотрансфузии.

Использование NAT-технологий, в частности метода ПЦР, позволяет выявить РНК HCV в крови уже через 1-2 недели после заражения, т.е. приблизительно за 60 дней до выявления в ней антител к HCV серологическими тестами.

HBsAg в большинстве случаев является наиболее значимым серологическим маркером острого и хронического ВГВ, выявление которого в крови свидетельствует с высокой степенью вероятности о присутствии в ней вируса . Однако, зарегистрированы случаи заражения ВГВ при переливании HBsAg-негативной крови. В настоящее время известно о существовании по крайней мере двух «ускользающих (escape)» мутантов HBsAg [9,13], которые могут возникать как естественным путем в ходе инфекционного процесса, так и после противовирусной терапии. Эти штаммы HBV способны передаваться горизонтальным путем и обусловливать ложно негативный результат при скрининге донорской крови на HBsAg. Описана, так называемая, «молчащая» форма ВГВ, характеризующаяся наличием низких концентраций вируса в крови при не детектируемом уровне HBsAg [2, 11]. Она может наблюдаться у некоторых больных после острого ВГВ с самостоятельным разрешением и даже после успешно проведенного противовирусного лечения, а также при хроническом ВГВ. Установлено, что «молчащая» инфекция представляет клиническую форму ВГВ, способную передаваться через компоненты крови, а диагностика ее основывается на тщательном сборе анамнеза и применении высокочувствительного метода ПЦР для определения вирусной ДНК [1].

Задачей настоящей работы было оценить целесообразность использования метода ПЦР для скрининга донорской крови на маркеры ВГС ВГВ.

Пробы крови от каждого донора забирали в 2 пробирки: одну пробирку с разделительным гелем для получения сыворотки для серологических исследований и вторую пробирку с ЭДТА для получения плазмы для ПЦР.

Скрининг донорских сывороток на серологические маркеры ВИЧ 1,2, ВГВ и ВГС проводили методом ИФА на аппарате Evolis (компания Biorad, США) или методом ИХЛА на аппарате Architect (компания Abott, США).

Для определения антител к HCV методами ИФА и ИХЛА использовали, соответственно, тест-системы Murex anti HCV (Abbott, США) и тест-системы Architect anti HCV (компания Abbott, США).

Для выявления HBsAg методом ИФА использовали тест-системы Monolisa HBsAg Ultra (Bio-Rad, США) и тест-системы Architect HBsAg (компания Abbott, США).

Образцы, показавшие при первичном исследовании в ИФА или ИХЛА положительный результат на анти ВИЧ 1,2, анти HCV или HBsAg, отбирали для повторного исследования в тех же тест-системах и подтверждающих тестах.

Все серонегативные образцы исследовали методом ПЦР на наличие РНК HIV, HCV и ДНК HBV.

В течение 2008 года ПЦР-исследования проводили на аппаратах Cobas Ampliprep/ Cobas Amplicor ( компания Roch, Швейцария) с использованием тест-систем: Cobas Ampliprep/Cobas Amplicor HIV 1 Monitor Test , Cobas Ampliprep/ Cobas Amplicor HCV Test и Cobas Amplicor HBV Monitor Test.

С января 2009 года исследования выполняли методом ПЦР в режиме реального времени на инструментальном комплексе Cobas 201 (Roche. Швейцария), включающем пипетирующую рабочую станцию, аппарат для автоматического выделения нуклеиновых кислот Cobas Ampliprep и анализатор Cobas Taqman для автоматического проведения амплификации и детектирования нуклеиновых кислот с использованием 5 нуклеазной технологии. Многоканальные оптические системы прибора позволяют регистрировать флуоресцентный сигнал от исследуемого образца в каждом цикле ПЦР. Для ПЦР-анализа серонегативных образцов использовали мультиплексные тест-системы CobasTaqScreen MPX Test, разработанные компанией Roche специально для скрининга донорской крови [10]. За счет включения в реакционную смесь различных пар специфических праймеров и зондов эти системы позволяют выявлять одновременно в одной пробирке РНК HIV-1 rpyппы М и группы О, HIV-2, HCV и ДНК HBV. Образцы, при исследовании которых регистрировали нарастание флуоресцентного сигнала, считали положительными, т.е. содержащими вирусную РНК (ДНК). Такие образцы исследовали повторно в той же тест-системе. При получении повторно положительного результата проводили идентификацию выявленной нуклеиновой кислоты с помощью указанных выше ПЦР-диагностикумов на отдельные инфекции.

Результаты исследования представлены в таблицах 1 и 2.

Читайте также:  Должностная инструкция менеджера продажам рекламы

Таблица 1 — Результаты исследования серонегативных образцов донорской крови методом ПЦР на комплексе Cobas Ampliprep/Cobas Amplicor

Источник

HCV, РНК количественно [реал-тайм ПЦР]

Исследование для выявления возбудителя гепатита C (HCV), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется наличие генетического материала (РНК) вируса и его количество (вирусная нагрузка) в образце крови.

РНК HCV может быть обнаружена в концентрации, находящейся за нижней границей линейного диапазона концентраций. Линейный диапазон концентраций – это диапазон, в котором можно точно посчитать количество копий возбудителя. Для данного анализа линейный диапазон концентраций РНК HCV, определяемых тест-системой: 150-1*10^8 МЕ/мл.

Вирус гепатита С (ВГС), количественное определение РНК.

Синонимы английские

Hepatitis C Virus RNA, Quantitative, Real-Time PCR, Blood, HCV Viral Load, Hepatitis C Virus RNA Quant.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

  • Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Вирус гепатита С (HCV) – РНКсодержащий вирус из семейства Flaviviridae, который поражает печень. Он способен размножаться в клетках крови (нейтрофилах, моноцитах и макрофагах, В-лимфоцитах) и вызывать криоглобулинемию, болезнь Шегрена и В-клеточные лимфопролиферативные заболевания. HCV благодаря высокой мутационной активности способен избегать воздействия защитных механизмов иммунной системы. Существует 6 генотипов и множество субтипов вируса, которые имеют разные значения для прогноза развития заболевания и эффективности противовирусной терапии.

Основной путь передачи инфекции – через кровь (препараты для переливания элементов крови и плазмы, донорские органы, нестерильные шприцы, иглы, инструменты для татуирования, пирсинга). Вероятно заражение при половом контакте и ребенка от матери во время родов, но это случается нечасто.

Острый вирусный гепатит, как правило, характеризуется бессимптомным течением и остается невыявленным в большинстве случаев. Только у 15 % инфицированных заболевание протекает остро – с тошнотой, ломотой в теле, отсутствием аппетита и потерей веса (редко сопровождается желтухой). У 60-85 % инфицированных развивается хроническая инфекция, что в 15 раз превышает частоту хронизации при гепатите В. Хронический вирусный гепатит С протекает с повышением печеночных ферментов и скудным проявлением симптомов. У 20-30 % больных заболевание приводит к циррозу печени, увеличивая риск развития печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы.

Выявление РНК HCV свидетельствует о размножении вируса в организме и является методом диагностики заболевания. Генетический материал вируса можно обнаружить с помощью ПЦР через 10-12 дней после инфицирования – в этот период специфические антитела, которые образуются через несколько месяцев после заражения, отсутствуют и биохимические показатели функции печени находятся в пределах референсных значений.

Посредством ПЦР выявляют РНК вируса качественно или количественно. Благодаря качественному методу подтверждается присутствие вируса гепатита С и его активное размножение. Количественное определение вирусной нагрузки с учетом генотипа HCV позволяет контролировать проводимую терапию и прогнозировать течение болезни.

Эффективность лечения оценивается по количеству РНК до и во время терапии. Обычно вирусная нагрузка крови снижается в несколько раз за первые три месяца успешного лечения. При эффективной терапии виремия уменьшается на два порядка в первые 4-12 недель лечения и после окончания курса терапии генетический материал вируса в крови не обнаруживается. Отсутствие снижения виремии через 12 недель с начала лечения указывает на его неэффективность. Рекомендовано проводить анализ до начала терапии, на 4-й, 12-й и 24-й неделях лечения и через 24 недели после окончания курса. Длительность терапии и периодичность количественного определения РНК вируса гепатита С зависит от генотипа вируса и степени повреждения печени.

Для чего используется исследование?

  • Для подтверждения диагноза «вирусный гепатит С».
  • Для прогнозирования течения вирусного гепатита С.
  • Для мониторинга противовирусной терапии и решения вопроса о дальнейшей тактике лечения.

Когда назначается исследование?

  • При качественном обнаружении РНК вируса гепатита С.
  • При остром и хроническом вирусном гепатите С.
  • При микст-гепатитах.
  • При планировании, во время и после окончания противовирусной терапии.

Что означают результаты?

Референсные значения: не обнаружено.

  • Не обнаружено – РНК вируса гепатита С не обнаружена или значение ниже предела чувствительности метода (50 МЕ/мл).
  • 1*10^8 МЕ/мл – РНК вируса гепатита С обнаружена в концентрации выше линейного диапазона концентраций.

Линейный диапазон концентраций РНК вируса гепатита С, определяемых тест-системой, составляет 150-1*10^8 МЕ/мл.

  • Уровень вирусной нагрузки крови не указывает на степень повреждения печени и тяжесть заболевания. Для их оценки необходимо исследовать биохимические показатели и материалы биопсии.
  • При планировании лечения очень важно определить генотип вируса гепатита С.

Кто назначает исследование?

Литература

  • Возианова Ж.И. Инфекционные и паразитарные болезни: В 3х т. — К.: Здоровье, 2000. – Т.1.: 600-690.
  • Кишкун А.А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике. — М.:ООО МИА, 2006. – 471-476 с.
  • Harrison’s Principles of Internal Medicine. 16 th ed. NY: McGraw-Hill; 2005: 1822-1855.
  • Lerat H, Rumin S, Habersetzer F, and others. In vivo tropism of hepatitis C virus genomic sequences in hematopoietic cells: influence of viral load, viral genotype, and cell phenotype. Blood. 1998 May 15;91(10):3841-9.PMID:9573022.
  • Revie D, Salahuddin SZ. Human cell types important for hepatitis C virus replication in vivo and in vitro: old assertions and current evidence. Virol J. 2011 Jul 11;8:346. doi: 10.1186/1743-422X-8-346. PMID:21745397.
Читайте также:  Инструкция и руководство для VR MW M1702 на русском

Источник



Вирус гепатита С (качественный метод)

Описание Показания Подготовка Интерпретация

Описание исследования

Гепатита С (HCV) – это вирусная инфекция, поражающая печень. Она зачастую сразу носит хронический характер и может никак себя не проявлять (иметь латентное течение), а также вызывает нарушение работы иммунной системы организма. В 5 случаях из 100 заболевание характеризуется наличием желтухи, в 95% протекает в безжелтушной форме.

Вирус гепатита С входит в семейство т.н. флавивирусов и отличается высокой устойчивостью к воздействию внешней среды. Белки, составляющие его (их всего три), выступают в роли антигенов со сходными между собой свойствами. Они-то и обуславливают продукцию антител anti-HCV-core.

На сегодняшний день определено 6 подвидов вируса. Такое обилие генетических вариантов делает его «трудноуловимым» для иммунной системы организма, что создает проблемы при разработке вакцины и постановке диагноза в лабораторных условиях (если антитела при инфицировании отсутствуют или не определяются из-за крайне незначительного количества, т.н. серонегативная форма гепатита С). Эта изменчивость вируса является также причиной того, что болезнь изначально может иметь хроническую форму.

Инфицирование гепатитом С происходит:

  • парентерально (при внутривенных инъекциях, переливании крови или ее компонентов, использовании аппарата искусственной почки, пересадке органов);
  • половым путем (особенно подвержены риску инфицирования люди, ведущие беспорядочную половую жизнь или имеющие незащищенный половой контакт);
  • трансплацентарным путем (от инфицированной матери к вынашиваемому ребенку).

В подавляющем большинстве случаев заражение происходит через кровь, половым путем крайне редко. Особенную опасность вирус гепатита С представляет для колющихся наркоманов, медработников, пациентов с почечной недостаточностью, лиц, нуждающихся в переливании крови; часто меняющих половых партнеров, находящихся в местах лишения свободы.

При попадании в организм, вирус проникает в макрофаги крови (клетки, захватывающие инородные и вредные вещества) и клеточные структуры печени и начинает в них процесс клонирования (самовоспроизведения). Это приводит к разрушению клеток печени. Кроме того, разрушаются клетки, отвечающие за иммунный ответ, что обусловлено схожестью антигенов вируса и антигенов гистосовместимости (системы тканевой совместимости человека).

Системные проявления действия вируса могут выражаться в возникновении следующих аутоиммунных состояний (они характеризуются тем, что иммунная система организма начинает бороться сама с собой):

  • аутоиммунного тиреоидита (воспаления щитовидной железы);
  • синдрома Шегрена (прогрессирующего аутоиммунного поражения соединительной ткани и желез внешней секреции, особенно слезных и слюнных);
  • идеопатической тромбоцитопенической пурпуры (снижения в крови уровня тромбоцитов, что повышает кровоточивость и понижает сворачиваемость);
  • гломерулонефрита (поражения клубочков почек);
  • ревматоидного артрита и пр.

В отличие от других видов гепатитов, гепатит С чаще других принимает хроническую форму и меньше проявляется клинически. Статистические данные говорят о том, что у 20-50 человек из 100 заболевших, осложнением инфекции становится развитие цирроза, а у 1,25 – 2,5% – возникает рак печени.

Продолжительность инкубационного периода инфекции – от 5 до 20 дней. Его конец характеризуется повышением концентрации в крови ферментов, вырабатываемых печенью (трансаминаз), что происходит по причине разрушения печеночных клеток. Для острого периода характерны слабость, ухудшение аппетита. В трети случаев болезнь сопровождается лихорадкой, артралгией (болями в суставах), полиморфной сыпью (сыпью, состоящей из разных элементов – папул, геморрагий, везикул, булл и пр.). Иногда у пациентов присутствуют боли в верхней части живота и полинейропатия (поражение периферических нервов, вызывающее снижение чувствительности, вялые параличи и пр.). Всего у 5% пациентов наблюдаются застойные явления в желчных путях. В результате лабораторных исследований обнаруживается наличие цитолиза (полного или частичного растворения клеток под воздействием антител). Уровень печеночных трансминаз, пятикратно превышающий нормальный, и наличие признаков печеночно-клеточной недостаточности дает повод предположить поражение организма одновременно двумя вирусами гепатита – С и В.

Данное исследование позволяет обнаружить РНК вируса гепатита С (ВГС) в сыворотке крови пациента. Тестирование проводится методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с выявлением специфических фрагментов РНК вируса гепатита С в режиме «онлайн». Суть молекулярно-биологического метода ПЦР состоит в значительном увеличении низких концентраций участков РНК вируса и отслеживании их в реальном времени.

  • предметом исследования является специфичный участок РНК вируса гепатита С;
  • генотипы, которые выявляются в результате исследования (независимо от их субтипа): 1а, 1b, 2a, 2b, 2c, 2i, 3, 4, 5a, 6;
  • специфичность теста – 100%;
  • чувствительность определения – 60 МЕ/мл (международных единиц на миллилитр).

Исходя из рекомендаций ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения) относительно гепатита С, окончательный диагноз устанавливается в случае, когда РНК ВГС в сыворотке крови выявляется трижды. Кроме того, условием для установления диагноза является отсутствие прочих показателей гепатита у пациента. На острой стадии гепатита С, РНК вируса обнаруживается в сыворотке крови уже спустя 1-2 недели после заражения, тогда как антитела к инфекции появляются в организме гораздо позже.

Подготовка к исследованию

Специальных требований к сбору материала не предъявляется.

  • наиболее благоприятным временем для сдачи крови является 8-11 часов утра, натощак;
  • перед исследованием нежелательны интенсивные физические и психоэмоциональные нагрузки;
  • за сутки до забора крови запрещено употреблять алкоголь;
  • за час до исследования запрещено курение;
  • необходимо согласовать с лечащим врачом возможность временной отмены лекарственных препаратов, которые могут повлиять на корректность результатов тестирования;
  • нежелательна сдача крови после физиопроцедур, инструментального, мануального, ультразвукового, ректального обследования, биопсии, кольпоскопии, гастроскопии и прочих манипуляций;
  • перед сдачей анализа крови желательно 10-15 минут провести в спокойствии.
Читайте также:  Гриль саламандра электрический Airhot SGE 460

Показания к исследованию

  • при явном проявлении признаков гепатита;
  • при профилактических первичных исследованиях РНК вируса гепатита С – самого раннего показателя острой инфекции;
  • при обследовании лиц, контактировавших с пациентом;
  • при диагностике гепатитов смешанного происхождения для определения более сильного вируса;
  • при циррозе печени;
  • с целью определения периода активного воспроизводства вируса при хронической форме болезни;
  • с целью наблюдения за действенностью назначенного лечения.

Интерпретация исследования

Данный тест является качественным. Ответ предоставляется в одном из вариантов: «обнаружено» или «не обнаружено».

  • в сыворотке крови найден фрагмент РНК, характерный для вируса гепатита С, что свидетельствует о заражении вирусом гепатита С;
  • в сыворотке крови не обнаружен фрагмент РНК, характерный для вируса гепатита;
  • количество РНК возбудителя в образце меньше нижнего предела чувствительности теста.

Важно! Сроки выполнения исследований полимеразной цепной реакции могут быть продлены при необходимости проведения подтверждающих тестов.

Результат теста выдается на бланке лаборатории медицинской компании «Наука». Пример по данному анализу представлен ниже:

Ф.И.О.: Иванов Иван Иванович Пол: м Год рождения: 01.01.0000

Дата исследования: 12.12.0000

Источник

Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов Ведерников, Виталий Евгеньевич

Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация, — 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Ведерников, Виталий Евгеньевич. Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов : диссертация . кандидата биологических наук : 03.01.06 / Ведерников Виталий Евгеньевич; [Место защиты: Гос. науч. центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»].- Новосибирск, 2011.- 224 с.: ил. РГБ ОД, 61 11-3/892

Введение к работе

Актуальность исследования

Несмотря на значительные усилия, предпринимаемые в течение многих лет службами здравоохранения большинства государств по предотвращению распространения гепатита С (ГС), эта инфекция и в настоящее время является актуальной мировой проблемой. По данным экспертов на земном шаре насчитывается более 500 млн. человек, инфицированных вирусом гепатита С (ВГС), в Российской Федерации их число приближается к 5 млн.

Ситуацию в значительной мере осложняет отсутствие вакцины против ГС и высокая частота протекания инфекции в скрытой бессимптомной форме. Поэтому актуальными задачами для здравоохранения всех стран являются: профилактические меры по снижению риска заражения ВГС, повышение эффективности выявления инфицированных лиц и проведение действенной противовирусной терапии. Для диагностики гепатита С в настоящее время применяется комплекс методов, включающих определение в сыворотке крови обследуемых людей антител к вирусным антигенам с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблота, а также обнаружение вирусной РНК ВГС с использованием технологий амплификационного тестирования нуклеиновых кислот (NAT).

NAT-тесты актуальны в трансфузиологии, так как позволяют выявлять РНК ВГС в ИФА-отрицательных пробах крови, полученных в период сероконверсионного окна (Жибурт и др., 2006). В современные алгоритмы первичного обследования и проведения противовирусной терапии NAT-тесты включены для выявления, количественного определения и генотипирования ВГС (в зависимости от генотипа ВГС назначают дозы препаратов и продолжительность лечения).

Российские медицинские учреждения в настоящее время не располагают достаточным ассортиментом диагностических наборов отечественного производства с требуемыми аналитическими характеристиками и актуальными для лабораторной диагностики потребительскими качествами. Представленные на отечественном рынке импортные диагностические тесты ведущих мировых производителей ограниченно доступны вследствие высокой стоимости. Поэтому для существенного улучшения ситуации с NAT-тестированием ВГС в России актуальна разработка и внедрение новых отечественных диагностических наборов.

Целью настоящего исследования является разработка, валидация и апробация наборов реагентов для количественного определения и дифференциации генотипов 1, 2, 3 вируса гепатита С на основе ПЦР в реальном времени.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

подобрать специфические праймеры и зонды для выявления РНК ВГС; выполнить оптимизацию условий проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени; совместить этапы обратной транскрипции и ПЦР;

провести оптимизацию методики проведения количественного анализа путем разработки алгоритмов обработки исходных флуоресцентных данных.

разработать композицию праймеров и генотип-специфичных флуорогенных зондов, обеспечивающую максимальную специфичность и позволяющую в одной пробирке одновременно выявлять генотипы 1, 2 и 3 ВГС; провести оптимизацию условий проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени;

на основе проведенных исследований разработать диагностические наборы для выявления РНК и генотипирования ВГС; определить их основные аналитические и диагностические характеристики; провести апробацию.

Научная новизна

В рамках разработки процедуры проведения количественного анализа предложен алгоритм устранения разрывов/выбросов в графиках флуоресцентных кривых с последующей обработкой фильтром высокочастотного шума. Такой алгоритм позволяет значительно повысить точность анализа при наличии в флуоресцентных кривых скачков и разрывов.

Предложен оригинальный алгоритм введения поправки на внутренний контрольный образец (ВКО) для учета потерь НК в процессе про-боподготовки, суть которой заключается в смещении значения Cq ВГС на Д Cq ВКО относительно среднего Cq ВКО по всей постановке.

При достигнутой воспроизводимости анализа (SD Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов

Источник